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杜鹃花瓣彩斑是决定其视觉效果与品种辨识度的核心观赏特征,但其动态变化的分子调控机制尚不明确。前期研究表明,R2R3-MYB转录因子在花青素合成及色素空间分布中起决定性作用。本研究通过从溪畔杜鹃(Rhododendron rivulare)中克隆候选转录因子RrMYB17,系统解析其结构、表达及功能以阐明其在彩斑形成中的分子调控机制,为杜鹃花色性状的分子育种提供理论依据。本研究以不同发育阶段的溪畔杜鹃花瓣及根、茎、叶等器官为材料。利用生物信息学在线工具全面分析其理化性质、保守结构域及启动子顺式作用元件等特征;采用qRT-PCR技术测定其在不同组织及发育时期的表达模式;构建GFP标签的过表达载体,利用农杆菌介导法瞬时转化本氏烟草与杜鹃活体花瓣,结合转录组和代谢组联合分析与分子对接技术,预测RrMYB17转录因子潜在的分子调控机制。主要研究内容如下: (1)成功克隆获得全长1095 bp的RrMYB17序列,编码364个氨基酸残基,属于非跨膜的亲水性不稳定蛋白。该蛋白属于典型的R2R3-MYB转录因子,但其决定花青素正向激活特异性的关键基序发生突变,且缺失经典的EAR主动转录抑制基序。 (2)亚细胞定位发现融合蛋白同时分布于细胞核与细胞质中,具有潜在的核质穿梭特征。时空表达模式揭示该基因在茎、叶和花瓣中表达量最高。在花瓣发育过程中,非彩斑区域的表达量显著高于彩斑区域;非彩斑区呈先升后降趋势,而彩斑区持续下降并维持极低水平表达。 (3)瞬时转化实验表明,在花瓣活体注射中,本源溪畔杜鹃表型与色差数值出现显著的色素消退,异源锦绣杜鹃和映山红表型和色差数据均未出现明显变化,表现了RrMYB17对花青素合成的负调控特征。 (4)多组学与分子对接分析预测发现,RrMYB17可能通过特定残基与F3'5'H和DFR启动子直接形成稳定氢键进行转录调控。推测它能以超越内源激活因子的极高亲和力优先与bHLH辅助因子AN1发生竞争性结合,导致核内积累大量无功能的异源二聚体以此阻碍激活型MBW复合体的形成,阻断底物向花青素的代谢流。
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